CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經成為一個強大的基因編輯工具,因為其高的靶向特異性,編輯效率和易用性。該技術的強大主要源于它的簡單,因為全部只需要一個Cas9核酸酶結合一個單鏈向導RNA(single guide RNA,sgRNA) 就可以決定靶向特異性(Jinek et al. 2012)。這種RNA編程的(RNA-programmable)方法利用了非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ) DNA修復途徑的易錯特性,進而產生基因敲除(通過插入/刪除)。這種方法也可以通過同源重組(homology-directed repair,HDR)途徑被用于基因敲入。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組件可以通過多種方法成功導入至靶細胞,包括基于載體的表達系統(tǒng),RNA轉染, 導入Cas9/sgRNA核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)復合物(Sander and Joung 2014)等。與基于載體的方法相比,直接導入Cas9/sgRNA RNPs提供了一種快速轉入基因編輯實驗的方法,同時脫靶效應的可能性更?。↘im et al. 2014)。
一旦Cas9/sgRNA RNP復合物被導入,為了分離和篩選感興趣的基因型,單細胞必須被分離并擴增為克隆細胞系。傳統(tǒng)上,從基因編輯的hiPS細胞建立一個克隆群是低效的、具有挑戰(zhàn)性的和耗時的,因為hiPS 細胞是以集落生長和傳代的。通常,這會導致細胞死亡和提前分化。然而,Cellartis基因編輯和單細胞克隆系統(tǒng)包含一個成分確定的培養(yǎng)系統(tǒng)(由基礎培養(yǎng)基,包被劑,和添加劑組成),用于有效形成單細胞克隆和擴增基因編輯后的hiPSC克隆。DEF-CS culture system (Asplund et al. 2016)是一個基于單層培養(yǎng)的系統(tǒng),規(guī)避了集落狀培養(yǎng)帶來的挑戰(zhàn),允許單細胞傳代和促進接種的單細胞存活和后續(xù)擴增。
Cellartis iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS Culture Media Kit (Code No. Y30021) 是一個完整的,在無飼養(yǎng)層和成分確定條件下,用于hiPSCs有效擴增和擴大生產的系統(tǒng)。試劑盒包含了從接種單細胞至96孔板到擴增至48孔板過程中所有必要的試劑。單細胞克隆擴增后,hiPSCs可以使用Cellartis DEF-CS 500 Culture System (Code No. Y30010)繼續(xù)培養(yǎng)。
Cellartis iPSC rCas9 Electroporation and Single-Cell Cloning System (Code No. 632643) 是一個完整的系統(tǒng),允許通過電穿孔的方法對hiPSCs進行有效的基因編輯以及隨后的單細胞克隆形成和擴增至48孔板。該系統(tǒng)中提供了重組Cas9蛋白質,以及產生大量sgRNAs所有必要的試劑,用于電穿孔hiPSCs。系統(tǒng)中也包括Cellartis iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS Culture Media Kit (前面所述) 組份,用于進行基因編輯后的單細胞克隆形成和擴增。單細胞克隆擴增后,hiPSCs可以使用Cellartis DEF-CS 500 Culture System (Code No. Y30010)繼續(xù)培養(yǎng)。
Cellartis iPSC CRISPR/Cas9 Gesicle and Single-Cell Cloning System (Code No. 632642)是一個完整的系統(tǒng),允許通過gesicle導入Cas9/sgRNA復合物進行有效的基因編輯隨后的單細胞克隆形成和擴增至48孔板。Gesicles是一種無毒的、高效的、替代電穿孔的方法,不依賴昂貴的設備或耗材。系統(tǒng)中提供所有的必要試劑用于產生細胞衍生的納米囊泡(稱做gesicles),來轉導Cas9和sgRNA至hiPSCs。系統(tǒng)中也包括Cellartis iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS Culture Media Kit(前面所述)組份,用于進行基因編輯后的單細胞克隆形成和擴增。單細胞克隆擴增后,hiPSCs可以使用Cellartis DEF-CS 500 Culture System (Code No. Y30010)繼續(xù)培養(yǎng)。